編者按：
??夏日炎炎，又到了空調(diào)呼呼吹，跳進(jìn)泳池盡情戲水的季節(jié)，我們?cè)谙硎軟鏊耐瑫r(shí)，一種“城市文明病”-軍團(tuán)病，也悄悄的潛伏在我們身邊。此病到底是什么？引起此病的病原菌應(yīng)如何檢測(cè)？今天，小編就來跟大家聊一聊。
????何為軍團(tuán)菌，何為軍團(tuán)?。?/strong>
1976年美國(guó)費(fèi)城斯特拉福賓館召開退伍軍人大會(huì)，會(huì)后短期內(nèi)就有數(shù)百人發(fā)生細(xì)菌性肺炎，共221人發(fā)病，34人死亡。當(dāng)時(shí)未查明傳染源，按照流行病學(xué)分析，可能是聚會(huì)賓館導(dǎo)致，許多賓館工作人員具有免疫力。后來，從患者組織中分離出一種革蘭氏陰性桿菌——嗜肺軍團(tuán)菌，從而發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的細(xì)菌家族成員軍團(tuán)菌屬（Legionella）。此次疾病被命名為軍團(tuán)?。↙egionnaires’ disease,LD），也稱軍團(tuán)菌?。?em>Legionellosis）。
軍團(tuán)菌病癥的防治是世界性難題，它的傳播途徑類似于新冠病毒，自呼吸道侵入人體后，引起肺炎、胸膜炎、嘔吐、腹瀉、甚至休克和死亡。有報(bào)道稱軍團(tuán)菌致死率在5%-10%之前，也就是說再不考慮醫(yī)療擠兌的情況下，軍團(tuán)菌的致死率高于新冠，甚至接近非典。并且，此菌更易入侵免疫力低下人群，喜歡“專挑軟柿子捏”。
????軍團(tuán)菌潛伏在哪里？
軍團(tuán)菌主要存在天然淡水和長(zhǎng)時(shí)間不流通的人工水環(huán)境中，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，中央空調(diào)、冷卻塔、熱水淋浴器、空氣加濕器等不斷涌入我們的生活，在給生活帶來便利的同時(shí)，由于管理不善等因素也成為軍團(tuán)菌散播的工具。尤其疫期間，很多酒店、游泳池都關(guān)門停業(yè)，場(chǎng)所缺少維護(hù)，這就給軍團(tuán)菌提供了繁殖場(chǎng)所。因此，我國(guó)公共場(chǎng)所要求監(jiān)測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌。
軍團(tuán)菌有哪些特性？
根據(jù)伯杰手冊(cè)第九版分類，軍團(tuán)菌目（Legionellales），軍團(tuán)菌科（Legionellaceae)，軍團(tuán)菌屬(Legionella)。目前發(fā)現(xiàn)的軍團(tuán)菌屬中有58個(gè)種，3個(gè)亞群，70多種血清型，其中有26種被報(bào)道過引起人類感染，而嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)，是引起軍團(tuán)病的主要病原菌。
???? 軍團(tuán)菌是革蘭氏陰性桿菌，無芽孢無莢膜，有鞭毛能運(yùn)動(dòng)。專性需氧，普通有氧條件下培養(yǎng)會(huì)生長(zhǎng)，但若CO2含量為5%，生長(zhǎng)會(huì)更好。耐酸耐熱，所以對(duì)于雜菌較多的樣品，常采用酸處理或熱處理，提高軍團(tuán)菌檢出率。此外軍團(tuán)菌最顯著的特點(diǎn)是：嗜鐵性和對(duì)L-半胱氨酸有絕對(duì)的營(yíng)養(yǎng)需求。因此，在含有L-半胱氨酸的BCYE上生長(zhǎng)而在L-半胱氨酸缺失的BCYE上不生長(zhǎng)，是初步判斷是否是軍團(tuán)菌的重要依據(jù)。
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?軍團(tuán)菌如何分離培養(yǎng)?
目前公認(rèn)的最適宜軍團(tuán)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是活性炭酵母浸出物培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱：CYE）；此培養(yǎng)基基礎(chǔ)里加上鐵，L-半胱氨酸和α-酮戊二酸，成為BCYE培養(yǎng)基（也稱BCYEα）；自然樣品和臨床樣本中存在大量雜菌，故在BCYE基礎(chǔ)上添加萬古霉素、多粘菌素B和放線菌酮抑制雜菌生長(zhǎng)，稱為GVPC培養(yǎng)基。也有添加其他抗生素（例如：納他霉素或先鋒霉素，成為GCPN或CCCV等），但效果均不如GVPC。（參考 胡朝暉《軍團(tuán)菌選擇性分離培養(yǎng)基及其實(shí)用性比較研究》）
軍團(tuán)菌生長(zhǎng)緩慢，必須保證10天的充分培養(yǎng)，但可以自第2,3,4,5天開始檢查GVPC平板。在GVPC上菌落通常白色、灰色、藍(lán)色或紫色，也有深褐色、灰綠色、深紅色菌落，表面光滑，呈典型毛玻璃狀，在紫外燈下，部分軍團(tuán)菌有熒光（杜莫夫軍團(tuán)菌、博杰曼軍團(tuán)菌等），但嗜肺軍團(tuán)菌無熒光。
怎樣鎖定嗜肺軍團(tuán)菌？
GVPC分離出軍團(tuán)菌，BCYE與BCYE-CYS生長(zhǎng)試驗(yàn)鎖定軍團(tuán)菌屬后，如何判斷是否是嗜肺軍團(tuán)菌呢？國(guó)標(biāo)中嗜肺軍團(tuán)菌主要四項(xiàng)生化試驗(yàn)是：硝酸鹽還原（-）、尿素酶（-）、明膠液化（+）、水解馬尿酸（+）。根據(jù)表1-軍團(tuán)菌屬中各種軍團(tuán)菌生化特征，我們可以看出，馬尿酸水解試驗(yàn)陽性，是嗜肺軍團(tuán)菌區(qū)分于其他軍團(tuán)菌的重要試驗(yàn)。馬尿酸陽性幾乎就可以鎖定嗜肺軍團(tuán)菌與菲利軍團(tuán)菌。而明膠試驗(yàn)，通常需要培養(yǎng)7~14天，時(shí)效性不好，所以馬尿酸水解試驗(yàn)，是嗜肺軍團(tuán)菌判斷的首選試驗(yàn)。那么問題來了，嗜肺軍團(tuán)菌的馬尿酸試驗(yàn)，是使用三氯化鐵法還是茚三酮法？具體的試驗(yàn)操作如何呢？為何有人做馬尿酸水解試驗(yàn)陽性不明顯呢？這些問題國(guó)標(biāo)中都沒有答案，筆者來談?wù)勛约旱脑囼?yàn)經(jīng)驗(yàn)。
表1? 軍團(tuán)菌屬中各軍團(tuán)菌生化
馬尿酸水解試驗(yàn)操作要點(diǎn)一：
將0.1g馬尿酸生化鑒定試劑，溶于10mLPBS緩沖液中，制成1%含量的馬尿酸鈉試驗(yàn)管。用過濾除菌法除菌后，分裝在1.5mL-2mL無菌離心管中，備用。注意，馬尿酸鈉試劑不穩(wěn)定，最好使用近期配制的試劑。
馬尿酸水解試驗(yàn)操作要點(diǎn)二：
從BCYE平板上刮取大量軍團(tuán)菌到馬尿酸鈉試驗(yàn)管中，36℃±1℃水浴培養(yǎng)基4h，注意要水浴培養(yǎng)，培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)效果不如水浴培養(yǎng)效果好。而后加入0.2mL 3.5%茚三酮溶液，36℃±1℃再水浴10min判斷結(jié)果。出現(xiàn)紫色陽性，無顏色變化為陰性。
重要的事情說三遍：接種大量軍團(tuán)菌，水浴培養(yǎng)！接種大量軍團(tuán)菌，水浴培養(yǎng)！接種大量軍團(tuán)菌，水浴培養(yǎng)！
明膠實(shí)驗(yàn)的要點(diǎn)，同樣是接種量要大，而后36℃±1℃培養(yǎng)7-14天，從第7天開始觀察，每天觀察一次，直至出現(xiàn)液化。
之后血清結(jié)果，報(bào)告嗜肺軍團(tuán)菌結(jié)果，這里就不再贅述。
小結(jié)，軍團(tuán)菌并不神秘，只是屬于營(yíng)養(yǎng)苛求型細(xì)菌，初次分離時(shí)對(duì)鐵和L-半胱氨酸有絕對(duì)需求，生長(zhǎng)緩慢，因此在平板上培養(yǎng)時(shí)間為2-7天或7-14天，25℃到43℃均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度36℃。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、血平板和BYCE-CYS（缺少L-半胱氨酸）上均不能生長(zhǎng)，因此常以BCYE生長(zhǎng)、BYCE-CYS不生長(zhǎng)作為軍團(tuán)菌屬初步確定試驗(yàn)。由于嗜肺軍團(tuán)菌是軍團(tuán)菌屬家族中，為數(shù)不多的馬尿酸水解試驗(yàn)陽性菌，因此馬尿酸水解陽性就成為篩選的重要依據(jù)，用好這把利器就可以輕松鎖定嗜肺軍團(tuán)菌了。